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第22章 臭椿生物活性物质提取与成分鉴定

H.Molish在1937年首先提出植物化感作用的概念,并定义为:所有类型植物(含微生物)之间生物化学物质的相互作用。同时指出这种相互作用包括有害和有益两方面。20世纪80年代中期,E。L。Rice将有益作用和自毒作用补充到植物化感作用的定义中。植物的化感作用广泛存在于自然界中,与植物间的光、水分、养分和空间的竞争一起构成了植物之间的相互作用。植物化感作用的媒体是化学物质,被称为“化感物质”。必须指出,化感物质包含着更丰富的内容,它指植物所产生的影响其他生物生长、行为和种群生物学的化学物质,不仅包括植物间的化学作用物质,也包括植物和动物间的化学作用物质。植物化感物质是植物体分泌到环境中的代谢物或次生代谢物,它们分布于植物的根、茎、叶、花、果实或种子中。

臭椿是分布广泛的一种落叶阔叶树种,多以散生为主,大面积人工栽培始于20世纪中期,但由于其独特的生物学特性等原因,并未获得成功。目前,随着西部地区生态环境建设工程进程的加快,加之臭椿是光肩星天牛的免疫树种,在生产中逐渐被广泛采用。臭椿树体含有的多种挥发性化学物质具有杀虫、驱虫、治癌的作用已经被证实,但这些物质对其他植物的生长是否具有某种化感效应还未见有报道,而这在营造混交林时对混交树种或伴生树种的选择具有重要意义。本研究以臭椿根、枝、嫩枝叶以及根区土壤的提取液处理白菜(Brassica chinensis L.)、刺槐(Robinia pseudoacacia.L.)、萝卜(Raphanus sativus cv Sijihong)、白蜡(Fraxinus chineusis Roxb。)等种子或幼苗,以及杨树、柳树插穗,测定臭椿提取物对种子发芽、幼苗生长、插穗生根的影响,研究臭椿的化感作用及其机理。

(一)臭椿活性物质的提取

臭椿树体内的活性物质主要是一些挥发性物质。根据挥发性物质的性质,目前多采用水蒸气蒸馏、萃取等方法进行提取。所用的有机溶剂有乙醚、乙醇、丙酮等;使用的装置有水蒸气蒸馏装置、普通蒸馏装置、索氏提取器等。考虑到溶剂提取效果、回收性方便等原因,本研究主要以乙醚为有机溶剂。采用日本岛津GC/MS QP-2010型气相色谱质谱联用仪进行提取物成分分析。

1.试验材料

于臭椿植株的速生期(7月~8月)自宁夏大学农学院校园内8年生幼树上采集嫩枝叶、树皮、老枝、幼(荚)果。

2.试验方法

(1)挥发性物质提取

挥发性物质提取程序如下:

臭椿样品→粉碎→浸提→蒸馏粗提→回收有机溶剂精提浸提:取一定量样品(分别为臭椿嫩枝叶、树皮、老枝、幼果、树根)加少量蒸馏水粉碎,加入一定量有机溶剂浸提24h左右。

粗提:把浸提液置入水蒸气蒸馏装置,蒸气蒸馏约2~3h,即得蒸馏粗提液。

精提:把蒸馏粗提液置于普通蒸馏装置用水浴加热蒸馏,根据有机溶剂的沸点控制水浴温度,蒸馏回收有机溶剂。精提过程约4~5h,蒸馏结束后蒸馏瓶中的剩余物即为提取物(棕黄色油状物)。

(2)臭椿嫩叶的提取液提取

为了探讨适宜的提取方法,分别采用不同的材料用量,不同的溶剂比例,不同的浸泡时间等进行提取比较试验。剪取一定数量的臭椿嫩枝叶,带回宁夏大学农学院林学实验室冷藏备用。在室内将嫩枝叶初步剪碎,然后在粉碎机中将叶片粉碎。装入有不同乙醚与蒸馏水剂量的三角瓶中浸泡,采用水蒸气蒸馏法进行蒸馏,然后再进行水浴蒸馏,回收乙醚,最后所得的馏分略带黄色,即为挥发性物质。

(3)气相色谱与质谱条件

气相色谱条件:DB-5MS石英毛细管柱,30m×0.25mm,膜厚0.25μm;柱温60~200℃,程序升温,5℃/min;进样口温度230℃;柱压为127.8KPa,分流进样,分流比为40:1,进样量为2.0μl;载气为氦气,流速为52.6cm/s。

质谱条件:EI源;电离电压70Ev;离子源温度200℃;接口温度250℃;扫描质量范围75~300amu。

(二)臭椿提取物的提取与分析

1.臭椿嫩叶、茎、皮、根皮提取液提取

通过试验可以看出,在不同季节,挥发性生物活性物质的含量有所不同。在两个不同的浸泡时间下,提取出来的挥发性物质的百分率不同;其中浸泡4h的材料提取出来的挥发性物质的百分率远大于浸泡24h的材料提取出来的挥发性物质的百分率。此外,在选用的浸泡溶剂中,乙醚与蒸馏水的比例不同,所提取出来的挥发性物质的百分率也呈现明显的差异;所使用的材料量不同,对提取臭椿嫩枝叶中的挥发性物质的提取效果也有一定的影响。

(1)不同月份提取率比较

不同月份,臭椿嫩枝叶活性物质的提取百分率不同。选用嫩枝叶量为300g,乙醚与蒸馏水的浸泡比例接近1:3,浸泡时间为4h的试验数据进行比较,发现在七月份内,所提取的臭椿嫩枝叶活性物质的百分率最低,平均提取百分率为21.7%;在八月份内,提取百分率最高,平均为36.44%;在九月份内,所提取的臭椿嫩枝叶活性物质的百分率为27.2%。臭椿嫩枝叶的最高提取百分率比最低提取百分率高14.74%。由此可以得出,臭椿嫩枝叶的活性物质在八月份时的提取率高,可能此期间活性物质含量较高,这与这个植物的生长代谢活动有关。

(2)不同材料用量提取率比较

由于蒸馏时所用的烧瓶容量为2000ml,所以材料的用量不能太多。随着嫩叶用量的增加,臭椿嫩枝叶的挥发性物质提取百分率逐渐降低。在原始数据中,选取试验中乙醚与蒸馏水的浸泡比例为1:3.2,嫩叶浸泡时间为4h的试验数据进行比较,发现当嫩叶用量与烧瓶容量比例为1:6.4时,臭椿嫩枝叶的提取的百分率最小,平均提取百分率为24.84%;当嫩叶用量与烧瓶容量比例约为1:7时,臭椿嫩枝叶的提取的百分率最大,平均提取百分率为36.67%;当嫩叶用量与烧瓶容量比例为1:8.4时,臭椿嫩枝叶的平均提取百分率为29.87%。臭椿嫩枝叶最大的平均提取百分率与最小的平均提取百分率相差11.83%。由此可以得出:当嫩叶用量与烧瓶容量比例为1:7时,臭椿嫩枝叶的平均提取百分率最高,可作为提取臭椿挥发性物质的材料用量的最佳比例。

(3)不同溶剂比例提取率比较

随着蒸馏水在当浸泡溶剂中比例的增加,臭椿鲜叶的提取百分率呈现不规律的变化趋势。选用嫩叶用量为300g,嫩叶浸泡时间为4h,当浸泡溶剂中乙醚与蒸馏水的比例为1:3时,臭椿嫩枝叶的活性物质提取百分率最低,平均为16.45%;当乙醚与蒸馏水的比例为1:3.2时,臭椿嫩枝叶的提取的百分率最高,平均提取百分率为36.44%;当乙醚与蒸馏水的比例约为1:4.3时,提取百分率为19.35%。臭椿嫩枝叶的最高平均提取百分率和最低的平均提取百分率的差值为19.99%。由此可以得出:当乙醚与蒸馏水的比例为1:3.2时,可作为臭椿嫩枝叶挥发性物质提取的最佳溶剂混合比。

(4)不同浸泡时间的提取率比较

当臭椿嫩枝叶的浸泡时间发生变化时,臭椿嫩枝叶的提取百分率的变化较为显著。以试验中用嫩叶用量为300g,乙醚与蒸馏水的浸泡比例约为1:4的试验数据来看,当浸泡时间为4h,臭椿嫩枝叶的提取的百分率最高,平均提取百分率为32.3%;当浸泡时间为24h,臭椿嫩枝叶的提取的百分率最低,平均提取百分率只为8.34%。臭椿嫩枝叶的最低平均提取百分率比最高的平均提取百分率低23.96%。所以,当粉碎叶的浸泡时间为4h是臭椿嫩枝叶挥发性物质提取最佳浸泡的时间。

(5)不同的溶剂提取试验

对臭椿不同器官采用不同的溶剂进行提取,从臭椿嫩枝叶提取挥发性化学物质,以乙醚为有机溶剂提取效果较为理想,100g嫩叶样品中平均可以获得2.1ml提取物;而丙酮的提取率平均仅为1.4ml/100g。乙醚的沸点为34.5℃,蒸馏回收用时短,易于操作;而丙酮和乙醇的沸点分别为56.2℃、78.15℃,回收分离相对较费时。因此,乙醚是提取挥发性化学物质较为理想的有机溶剂。

不同器官的提取率明显不同。其中以嫩枝叶的提取率最高,为2.4ml/100g;其次为树皮,每100g可提取1.5ml;然后是老枝,每100g可提取1.2ml;根和幼果的提取率约为1ml/100g左右。说明臭椿各器官的生物活性物质的含量不同。在树木的生长发育进程中,嫩枝、叶的代谢活动相对较为旺盛,其合成能力也强,因此其代谢产物也较多,提取获得的提取物也较多;而根和幼果的代谢能力相对较弱,距代谢源距离相对较远,活性物质的含量也较低;老枝、树皮由于在整个生长季节内代谢物质的贮藏多,消耗较少,其活性物质的含量居中。

综合分析认为,影响臭椿挥发性化学物质提取的关键因子是有机溶剂种类与用量、提取时间等。臭椿嫩枝叶的提取结果可以看出浸提时间越长提取率则越高。一般情况下,浸提时间不得小于2h,以2~6h为宜;粗提时间以3~4h为宜,时间太短,则不能充分提取;若时间太长,又会混入一定量的水分;精提时间以4~5h为宜。提取有机溶剂用量不同,其提取效果也不一。试验表明,对臭椿化学物质提取的适宜溶剂用量为每克样品2~5ml。溶剂用量越多,提取效果越好,但若超过每克鲜样品5ml,则效果不佳,反而是一种浪费;提取的最低极限溶剂用量为每克鲜样品1ml溶剂。

2.臭椿的嫩叶、茎、皮、根皮提取液分析

臭椿的嫩叶、茎、皮、根皮提取液分析中含有多种化学物质,具有杀虫、驱虫、治癌等生物活性。臭椿嫩枝叶中的提取物为红橙色或淡黄色,有较强的刺激性气味;树皮提取物为淡黄色,有刺激性气味;老枝中提取物为淡黄色,刺激性气味较弱;根和幼果中提取物为淡黄色,有油香味兼有一定刺激气味。各提取物色度和气味略有不同,由此可以推断其主要成分略有不同。

将提取物样品3号、样品8号、样品17号送至宁夏大学能源化工重点实验室,采用日本岛津GC/MS QP-2010型气质谱联用仪进行成分测定。测定的色谱条件:DB-5MS石英毛细管柱,30m×0.25mm,膜厚0.25μm;柱温60℃~200℃,程序升温,5℃/min;进样口温度230℃;柱压为127.8KPa,分流进样,分流比为40:1,进样量为2.0μl;载气为氦气,流速为52.6cm/s。

在本试验条件下,共分出37个色谱峰,鉴定出37个化合物。

在臭椿挥发性提取物中含量较高的化合物有甲苯(3.99%)、2,5-二甲基二氢呋喃(20.93%)、丁香烯(8.94%)、α-荜澄茄油烯29.29%,占到提取物总成分含量的62.15%,烷类为4.24%,醇类为2.07%,苯类为4.24%,其他2.65%。根据这个化学成分分析结果可知,臭椿挥发性提取物中萜烯类化合物含量较多,它们在室温下较易挥发,可能是挥发性物质的重要组成部分。但实验中也发现,臭椿提取物中的化学成分因季节、提取方法、器官部位等而有变化,还需进一步深入研究。

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