抗氧化剂本身会被氧化，样品随着存放时间的延长含量会下降，所以样品进入实验室应尽快分析，避免结果偏低。用柱层分离含油脂多的食品，会受到温度的影响，室温温度低，流速缓慢，使分离效果受一些影响，最好温度在20℃以上进行分离。BHT稳定性较差，易受阳光，热的影响，操作时应尽量避光。脂肪过柱净化处理时应注意：待湿法装柱石油醚自色谱柱停止流出时，立即将样品提取液倒入柱内，以防止时间过长柱层断裂，影响净化效果。
色谱柱进样口端管壁如出现小油点，必须换掉柱头玻璃棉。抗氧化剂在层析柱中停留的时间不宜太长，但淋洗速度也不能太快，控制在每分钟为4.0 mg/kg。气相色谱最佳线性范围为0.0～100.0 μg。本方法适用于糕点和植物油等食品中BHA、BHT的测定。检出限为2.0 μg，油脂取样量为0.50 g时检出浓度为4.0 mg/kg，最佳线性范围为0～100 μg。若样品为油脂时，另加5 mL正己烷溶解分散样品；对于凝固点低的油脂样品，应先于超声波清洗器上超声30 min，再于振荡器上振荡30 min，反复2次。
13.3.2薄层色谱法
用甲醇提取油脂或食品中的抗氧化剂，用薄层色谱定性，根据其在薄层板上显色后的最低检出量与标准品最低检出量比较而概略定量，对高脂肪食品中的BHT、BHA能定性检出。
（1）植物油(花生油、豆油、菜籽油、芝麻油)样品处理：于1具塞离心管中称取油样，加入甲醇，密塞振摇，放置后离心。吸取上层清液置容量瓶中，如此重复提取共5次，合并每次甲醇提取液，用甲醇定容。吸取甲醇提取液置于浓缩瓶中，于水浴减压浓缩，留作薄层色谱用。
（2）猪油样品的处理：于具塞磨口的锥形瓶中称取猪油，加入甲醇，装上冷凝管于水浴上放置，待猪油完全溶解后将锥形瓶连同冷凝管一起自水浴中取出，振摇，再放入水浴；如此振摇3次后放入水浴，使甲醇层与油层分清后，将锥形瓶同冷凝管一起置冰水浴中冷却，猪油凝固。甲醇提取液通过滤纸滤入；置容量瓶中，再自冷凝管顶端加入甲醇，重复振摇提取1次，合并2次甲醇提取液，将该容量瓶置暗处放置，待升至室温后，用甲醇定容。吸取甲醇提取液置浓缩瓶中，于水浴上减压浓缩，留作薄层色谱用。
此法也适用于其他含油食品的测定。对于油炸花生米、酥糖、巧克力、饼干等食品的处理分析可首先测定脂肪含量，与气相色谱法中固体样品提取脂肪方法相同。而后称取约2.00 g的脂肪，视提取的油脂是植物油还是动物油而决定提取方法。此法可同时定性检出PG。BHT、BHA、PG薄层色谱最低检出量、Rt值及斑点颜色变化见表13-1。如果试样点的色斑颜色较标准点深，可稀释后重新点样，估算含量。显色剂溶液见光易变质，应将此溶液配制后存于棕色瓶，最好临用时配制。配制时的溶液保存于冰箱中可供3 d使用。若点样量较大，可采取边点样边用吹风机吹干，点上一滴吹干后再继续点加。以免样点过大，影响展开结果。增大点样量，杂质干扰明显，尤其对硅胶板上的BHA。薄层板必须涂布均匀。当点大量样液时，由于杂质多，样品中BHT或BHA点的Rt值可能略低于标准点。这时应在样品点上滴加标准溶液作内标，比较Rt值。
13.3.3比色法
试样通过水蒸气蒸馏，使BHT分离，用甲醇吸收，遇邻联二茴香胺与亚硝酸钠溶液生成橙红色，用三氯甲烷提取，与标准比较定量。
称取试样于蒸馏瓶中，加无水氯化钙粉末及水，当甘油浴温度达到165℃恒温时，将蒸馏瓶浸入甘油浴中，连接好水蒸气发生装置及冷凝，冷凝管下端浸入盛有甲醇的容量瓶中，进行蒸馏，蒸馏速度1.5～2.0 mL/min，在50～60 min内收集约100 mL馏出液，用温热的甲醇分次洗涤冷凝管，洗液并入容量瓶中并稀释至刻度。
本方法检出量为10.0 μg，油脂取样量为0.25 g时检出浓度为4.0 mg/kg。
13.3.4高效液相色谱法
直接用甲醇提取样品中的BHT、BHA，然后经反相C18柱分离后，用紫外检测器280 nm检测，外标法定量。
取混合均匀的样品，加甲醇浸没样品，置于振荡器上振荡，静置，上清液用0.45 μm滤膜过滤，进样20 μL进行分析。
此法适用于植物油中BHT、BHA的检测，此外，可同时检测TBHQ。
13.3.5几种方法的比较
比色法仪器普及，方法较简便。薄层色谱法费用低、较快捷且简便易行。气相色谱法在样品前处理中，使用石油醚溶解油样过层析柱，用二氯甲烷分数次淋洗减压提干，最后用二硫化碳定容。其前处理净化、分离过程复杂繁琐容易造成样品中测定成分损失、净化不彻底，且采用试剂毒性大。而高效液相色谱法检测很好地避免了这些缺点，但在日常检测工作中，使用该标准方法进行检测，会因不同抗氧化剂的提取率不一致，而造成检测回收率偏低的问题。
用于分析脂肪类食品中BHA、BHT的方法现有很多，选择哪种方法取决于待分析的食品。这些检测方法主要应用于液态食品，比如油脂类，随着方法的进一步发展，将使分析检测方法可适用于所有食品中BHA和BHT的检测。
13.4护色剂的测定
护色剂是能与肉及肉制品中呈色物质作用，使之在食品加工、保藏等过程中不致分解、破坏，呈现良好色泽的物质。我国食品添加剂使用标准中公布的发色剂有硝酸钠（钾）和亚硝酸钠（钾），它们主要用于肉类加工，用于固定和增强肉的红色，改善肉的感官性状，并兼具抑制细菌，尤其是肉毒梭状芽孢杆菌生长的作用。但摄入多量亚硝酸盐进入血液后，可使正常的血红蛋白变成高铁血红蛋白，从而失去携氧功能，导致组织缺氧，出现头晕、恶心，严重者出现呼吸困难、昏迷等症状，且在一定条件下，亚硝酸盐可与二级胺形成具有致癌作用的亚硝胺类化合物，而硝酸钠（钾）的毒性主要是在食品中、水中或胃肠道内被还原成亚硝酸盐所致。因此，食品标准除规定了发色剂的使用量外，还规定了残留量标准。在GB 2760-2011中，目前亚硝酸钠（钾）在允许使用的食品中的最大添加量为0.15 g/kg，残留量≤30 mg/kg（西式火腿类残留量≤70 mg/kg）；硝酸钠（钾）在允许使用的食品中的最大添加量为0.5 g/kg，残留量≤30 mg/kg（以亚硝酸钠计）。
硝酸盐和亚硝酸盐测定方法很多，公认的测定方法为格里斯试剂比色法测定亚硝酸盐含量，镉柱法测定硝酸盐含量。其他还有示波极谱法、气相色谱法、荧光法和离子选择性电极法等。
13.4.1亚硝酸盐的测定
亚硝酸盐的测定方法包括盐酸萘乙二胺比色法、极谱法、荧光法等。此外，还包括离子交换色谱法、流动分析法、差示脉冲极谱法、毛细管电泳法、导数光度法、催化动力学法、气相色谱法以及各种联用技术等。我国的国家标准方法为离子色谱法(GB/T 5009.33-2010第一法)、分光光度计法(GB/T 5009.33-2010第二法)、乳及乳制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定（GB/T 5009.33-2010第三法）。
13.4.1.1离子色谱法
试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，采用相应的方法提取和净化，以氢氧化钾溶液为淋洗液，阴离子交换柱分离，电导检测器检测。以保留时间定性，外标法定量。
不同样品处理方法如下。
（1）水果、蔬菜、鱼类、肉类、蛋类及其制品、腌鱼类、腌肉类及其他腌制品等：称取试样匀浆（精确至0.01 g，可适当调整试样的取样量，以下相同），以水洗入容量瓶中，超声提取，每隔5 min 振摇1次，保持固相完全分散。于水浴中放置，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液离心，上清液备用。
（2）乳和乳粉：称取试样（精确至0.01 g），置于容量瓶中，加水，摇匀，超声，加入3 %乙酸溶液，于4℃放置20 min，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤，取上清液备用。
取上述备用的上清液，通过0.22 μm 水性滤膜针头滤器、C18柱，弃去前面3 mL（如果氯离子大于100 mg/L，则需要依次通过针头滤器、C18柱、Ag柱和Na柱，弃去前面7 mL），收集后面洗脱液待测。
13.4.1.2分光光度法
亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定。试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。
称取（精确至0.01 g）制成匀浆的试样（如制备过程中加水，应按加水量折算），置于烧杯中，加饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以水将试样洗入容量瓶中，于沸水浴中加热，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。在振荡上述提取液时加入亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入乙酸锌溶液沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液，滤液备用。
本方法最低检出限为1.0 mg/kg，本实验用水应为重蒸馏水。
油脂多的样品，可冷却使脂肪凝固后再滤去或撇去脂肪；对有色样品，如红烧肉类，可取滤液于容量瓶中，加氢氧化铝乳液定容，过滤取其无色滤液进行比色测定。若加氢氧化铝乳后还有颜色，可加氢氧化铝乳液进行2次甚至3次脱色，直至无色为止。
13.4.1.3其他方法
除以上两种常见方法外，食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定方法还包括分光光度法、示波极谱法等。分光光度计法是利用磺胺和N-1-萘基-乙二胺二盐酸盐，使亚硝酸盐显粉红色，然后用分光光度计在538 nm 波长下测其吸光度。而示波极谱法则是利用样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性的条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，在弱碱性条件下再与8-羟基喹啉偶合形成橙色染料，该偶氮染料在汞电极上还原产生电流，电流与亚硝酸盐的浓度呈线性关系，与标准曲线比较定量。
13.4.2硝酸盐的测定
硝酸盐可用电极法、气相色谱法测定，也可通过被还原为亚硝酸盐来定量。
13.4.2.1离子色谱法
离子色谱法测定原理、仪器设备等与离子色谱法亚硝酸盐的含量一样。区别主要在于标准溶液不同，及结果计算不同。
13.4.2.2分光光度计法(镉柱法)
样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，溶液通过镉柱，或加入镉粉，使其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子，在弱酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N-1-萘基乙二胺偶合形成红色染料，测得亚硝酸盐总量，由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量。
样品预处理：同“亚硝酸盐的测定——盐酸萘乙二胺法”。
硝酸盐的还原：先以稀氨缓冲液冲洗镉柱，流速控制在3～5 mL/min，取处理过的样液于烧杯中，加氨缓冲溶液，混合后注入储液漏斗，使硝酸盐经镉柱还原，收集流出液，当储液漏斗中的样液流完后，再加水置换柱内留存的样液。将全部收集液如前再经镉柱还原1次，收集流出液，以水洗涤镉柱3次，洗涤液一并收集，加水定容。
亚硝酸钠总量的测定：取还原后的样液于比色管中。以下按盐酸萘乙二胺法测得亚硝酸盐总量，由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量。
本方法硝酸盐最低检出限为1.4 mg/kg。如无上述镉柱玻璃管时，可以25 mL酸式滴定管代用。在制取海绵状镉和装填镉柱时最好在水中进行，勿使镉粒暴露于空气中以免氧化。镉柱填装好及每次使用完毕后，应先用0.1 mol/L盐酸洗涤，再以水洗两次，镉柱不用时用水封盖，镉层不得夹有气泡。
为保证硝酸盐测定结果的准确性，应常检验镉柱的还原效率。镉柱维护得当，使用一年效能尚无显着变化。镉柱还原效率的测定：取硝酸钠标准使用液，加入稀氨缓冲液，混匀后按照分析步骤中“硝酸盐的还原”进行操作。取还原后的溶液于比色管中，按照“亚硝酸盐的测定”进行操作，根据标准曲线计算测得结果，与加入量相比较，还原效率应大于98%为符合要求。
在沉淀蛋白质时，硫酸锌溶液的用量不宜过多。否则，在经镉柱还原时，由于加氯化铵缓冲液而生成Zn(OH)2白色沉淀，堵塞镉柱，影响测定。
镉是有毒元素之一，不要接触到皮肤，一旦接触，立即用水冲洗。另外，不要将含有大量镉的溶液弃入下水道，应处理后弃去。
13.4.2.3电极测定法
在0.1 mol/L硫酸钾介质中，用硫酸银去除氯离子的干扰，硝酸根离子浓度在1×10-2～8×10-5 mol/L之间，电位值与硝酸根浓度的负对数呈线性关系，由此可求出样品中硝酸盐的含量。
准确取切碎混匀的样品置于研钵中，加入少量硫酸钾溶液磨匀后，用硫酸钾溶液稀释，摇匀，离心，吸取上清液，置于小烧杯中，加入硫酸银，用磁力搅拌器搅拌，静置后，取部分上清液约置于另一小烧杯中，插入电极，在磁力搅拌下读取电位值，然后根据标准曲线求出待测液中硝酸盐的含量。
