当地的土吏马邦聘不服覃氏继位，一直谋夺其印，纠结党羽围攻覃氏，纵火焚烧公私庐舍八十余所，杀掠一空。覃氏上书朝廷，要求对谋篡之事严惩。正在朝廷处理此事的过程中，播州的杨应龙开始反明。马千驷认为时机到了，立即率部赶到播州，与杨应龙会合。
马千乘因而有机会继承了马氏土司之位，应朝廷征调，讨伐杨应龙。至此，兄弟、母子反目成仇。万历二十七年(1599年)腊月，八路平叛大军汇集，川师四路，黔师三路，还有一路楚师。每路三万人马，主要力量皆为地方土司的军队。马千乘率本部三千军，为川南路先行，跟随四川总督李化龙从征。
石砫兵手持特制长矛，矛端呈勾状，矛尾有圆环，攀援险峻山地之时，前后搭接，敏捷如猿。由于矛杆皆为白色，时人称之为“白杆兵”。丈夫前线杀敌，秦良玉也自愿为朝廷效力，她统精兵五百，自备军粮马匹，扼守险地邓坎(今贵州凤岗)，引弓持剑杀贼。总督李化龙闻讯大为叹异，命人打造一面银牌，上镌“女中丈夫”四个大字，以示表彰。
万历二十八年(1600年)正月初二，明军由于连连克捷，又正值新年，部队上下都有所松懈，各路军马大摆酒宴， 马千乘也应邀前去大营赴宴。秦良玉预料到，在这种情况下，敌人很可能偷营劫寨，于是下令“白杆军”持矛裹甲，连夜分守险隘。半夜时分，杨应龙发动突袭，醉梦中的官军四处逃散。秦良玉夫妇与早有准备的“白杆兵”发起反突袭，播州军先胜后败，惶骇间被长矛捅倒无数，大败而逃。这次反偷袭战斗的胜利，各路官军一致认为良玉“应数战功第一”，“当时若无良玉，则官兵被袭，不知作何究竟”。
随后，各路大军马不停蹄，乘胜追击，连破叛军在桑木、娄山两关之外的金筑等七寨，扫除了进军黔北的第一道障碍，顺利进入贵州境内，直抵桑木关下。桑木关为杨应龙的军事要塞，山险沟深，易守难攻。杨应龙利用各种火器，凭高拒险坚守。
甲胄齐身的明军一时束手无策，“白杆兵”再显神威，他们的攀援能力本来就强，再加上特制的矛钩搭连，迅速地荡破险关。关口一经拿下，官军夺门而入，众人合兵，杨应龙败退，退守黔北要塞娄山关。
娄山关为黔北门户，雄关如铁，万峰插天，丛林之中，一径数尺，真正是一夫当关，万夫莫开。杨应龙增设木关十三座，置排栅，挖深濠，百险俱备，决意死守。明军兵分两路，绕山道由丛山中攀藤萝上关，暗伏其后，两下夹击。杨应龙自知抵挡不住，弃关从斜刺里逃遁。拿下娄山关，征播平叛取得了决定性胜利。
四月中旬，八路大军汇集杨应龙的老巢——播州海龙屯。明军坚筑长围，将海龙屯团团困住。各路军马轮番进攻，历时四十余日，终于拿下海龙囤。杨应龙叫妻儿各自逃命，安排随从放火，自己闭门上吊自杀，居室和尸身一并被焚毁。杨应龙之子杨朝栋与女婿马千驷等人，都被生擒。马千乘仍袭土司之位。
此次平乱，秦良玉、马千乘夫妇“为南川路战功第一”，“女将军”的称号开始传扬，此时秦良玉年仅26岁。也许是因为弟弟马千驷也参与叛乱的缘故，秦良玉夫妇对平播之功非常低调，夫妇二人仍回石砫本分生活。万历三十一年(1603年)十一月，川贵总督王象乾上书朝廷对秦良玉夫妇大加赞赏，称其功大却不言功，“何其勇且顺也”。 天启帝得知实情深为感动，即御赐“忠义可嘉”匾额，以旌其功。良玉携匾率部返回石砫，将匾悬于帅忠堂上，以显荣耀。
十年后，万历四十一年(1613年)八月，秦良玉丈夫马千乘冤死于云阳狱中。官方的说辞是，石砫部民状告马千乘，明廷才把他逮捕下狱。其实真实的原因是，马千乘因开矿一事得罪了太监邱乘云，邱乘云是万历皇帝派出的监税太监，他到石砫后向马千乘索贿，马千乘自恃于朝廷有功，没有理睬。碰了一鼻子灰的邱公公大怒，指使手下捏造罪名，把马土司逮捕入狱，活活折磨而死，马千乘时年仅41岁。
一下子变成孤儿寡母，秦良玉悲痛万分，但为顾全大局，她忍辱负重，殡敛丈夫后，袭任了石砫宣抚使之位，未有生出任何反叛之心，一直忠于职守，不负朝廷，成为抗击外族最为有力的女土司。这种顾全大局、忍辱负重，国家遇有危难即刻挺身而出的英雄气概，与传说中“杨家将”的风骨一脉相承。
万历四十四年(1616年)，女真酋长努尔哈赤在赫图阿拉(今辽宁新宾县)建立“大金”政权(即后金)，连连发动对明朝的进攻。两年后，萨尔浒一役，明军惨败，诸营皆溃。自此之后，驻辽明军一见到后金军便闻风而逃。
万历四十八年(1620年)六月，后金兵入侵辽东，东北告急，朝廷发出诏令在全国征兵援辽。秦良玉闻调，派兄长秦邦屏与弟弟秦民屏率五千白杆兵先行。第二年农历三月，后金兵围困沈阳。秦邦屏、秦民屏兄弟奉命驰援，兵至浑河时，得知沈阳失守。白杆兵率先渡过浑河，遭到了敌人的四面突袭。
秦氏兄弟率兵血战，杀死辫子兵数千，令战无不胜的八旗军胆寒。激战中，敌军主力增援，明军寡不敌众，邦屏捐躯沙场，民屏身负重伤突围脱险，两千多白杆兵战死。但自此以后，石砫“白杆兵”名闻天下。
得知兄长牺牲消息后，秦良玉制一千件冬衣，配送给远在辽地的石砫兵。四月，46岁的秦良玉亲统精卒三千，与儿子祥麟一起北上，所过之处秋毫无犯。
她率兵直抵榆关(今山海关)布防，控扼满洲兵入关咽喉，与后金兵遭遇。激战中，祥麟的眼睛中箭，但他毫无惧色，拔箭杀敌，血流如注，英勇如故，敌兵惊吓而退。此一役，祥麟被军中誉为“赵子龙”、“小马超”。朝廷闻报，御赐“忠义可嘉”匾额，赐秦良玉诰命夫人，进二品服，封诰褒奖。
秦良玉虽然受到封赏，但此次战争中的一些殉难者，却未得到应有的优恤。于是，良玉亲自立状，面呈天启帝，申述秦氏一行自平播以来的屡屡战功和对国家民族尽职尽责的耿耿忠心。特别是浑河战役，邦屏为国事英勇死难，理应予以优恤。秦良玉据理力争，很有点佘太君痛说家史的味道。朝廷即行追赠邦屏为都督佥事，享受世代恩荫，民屏也受到了重用。
由于“白杆兵”战斗力强，明廷下令再征兵两千。秦良玉闻诏即行，与弟弟秦民屏驰还石砫，征调士兵准备援辽。九月，秦良玉回到家乡，正逢重庆发生叛乱。永宁土司奢崇明借奉诏援辽之机，率马步兵二万，公然反抗朝廷，占据了重庆，然后发兵围攻成都。得知秦良玉返乡，奢土司派人前去送上重礼，要求与秦良玉结盟。
秦良玉对奢氏这种不顾国家民族利益，大搞分裂的叛乱行为，极为愤慨，下令斩杀来使，誓不同流。当时川地诸土司大多逗留观望，秦良玉则不然，亲率四千人马，倍道兼程，溯江西上，解围成都，收复重庆，于天启三年(1623年)，最终平定了永宁奢氏土司的叛乱，随后又平定了“松藩叛乱”。明朝廷封其为诰命夫人，授总兵一职。
秦良玉因功受封本来是很正常的事，却引起一些官军将领的妒嫉。在继续平叛的战斗中，竟有官员或闻风先遁，或坐地牵制，故意为难秦良玉。天启三年(1623年)六月，秦良玉在忍无可忍的情况下，上书朝廷奏明此情，直陈官军中存在的弊端。
她指出，官军中的一些将领，没见到敌人的时候大肆吹嘘，等到两军对垒却闻风先遁。打了败仗的生怕别人打胜仗，临敌怯阵的唯恐别人英勇。她还特别指斥总兵李维新，渡河一役，他不但不协同攻敌，反而败逃归营。当良玉问其究竟时，李竟闭门不见。对此，良玉感慨万端：“以六尺躯须眉男子，忌一巾帼妇人，静夜思之，亦当愧死！”
天启帝得报，即诏令安抚，要求文武大吏，对土官首领、有功之臣，一定要以礼相待，不得疑忌。感动之下，秦良玉更加为明廷卖命。
奢氏父子兵败后，相继逃往永宁老巢。是时，贵州水西土司安邦彦亦举兵叛乱，与奢氏“遥倚为声援”。安邦彦据水西，进黔北，以重兵困围贵阳，黔省震恐。巡抚王三善集各路军马尽力征剿。秦民屏及其二子佐明和祚明亦随军征战。在一次战役中，民屏力战殉国，二子佐明、祚明奋力突围，皆受重伤。安、奢之叛，历时7年才得以平息，秦良玉在平叛过程中发挥了重要作用。
崇祯三年(1630年)，皇太极率十万大军绕道长城喜峰口入侵，攻陷遵化后，直抵北京城外，连克永平等四城，畿辅震动。皇帝下诏令天下之师勤王，各方将领逗留不前。
